单细胞蛋白质组学（Single-Cell Proteomics, SCP）是当前生物学领域最前沿的研究方向之一，专注于解析单细胞层面的蛋白质表达谱及其动态变化。传统蛋白质组学技术主要面向群体或组织水平，难以揭示单个细胞的异质性。然而，细胞群体的异质性对组织功能、生物学机制乃至疾病发展起着重要作用，因此迫切需要针对单细胞层面的精准检测工具。近年来，基于质谱技术的单细胞蛋白质组学取得了显著进展，其检测灵敏度和通量不断提高，但在单个细胞内实现数千种蛋白质的高重复性定量依然面临诸多挑战。为此，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的Steven A. Carr和Claudia Ctortecka团队提出了一个专用的样品制备芯片--proteoCHIPEVO96技术，并结合Evosep One液相色谱系统，实现了高效、高通量、低损耗的单细胞蛋白质组学分析平台。proteoCHIP EVO 96技术的应用不仅推动了单细胞蛋白质组学领域的发展，还为研究复杂的生物学问题提供了全新的解决方案。作为生物质谱检测优质服务商，百泰派克生物科技致力于为广大科研工作者提供先进的高质量单细胞蛋白质组学分析一站式服务。
基于proteoCHIP EVO 96的全新工作流程，通过将单细胞样品直接转移到Evosep系统进行在线脱盐和分离，显著提高了蛋白质检测的深度与通量，并展示了其在单细胞水平上解析复杂生物现象的能力。该技术还支持全自动化操作，优化了单细胞样品的制备与进样流程。此外，2024年7月麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所团队于《Nature Communications》中发布了其关键研究结果与技术亮点：
1、proteoCHIP EVO 96最大限度地减少吸附肽损失
proteoCHIP EVO 96是一种微机械低吸附PTFE芯片，在96孔板的布局中具有锥形纳米孔。纳米空中提前注入 3 μL 十六烷。在这个纳米孔中进行样本的蛋白提取和酶切，减少了由于移液或样品转移而导致的吸附损失。同时将proteoCHIP EVO 96与Evotips盒的顶部连接，通过改变proteoCHIP EVO 96的温度，使液体样品滴与固体十六烷完全分离（以在每个Evotip适配到每个纳米孔，其与高效液相色谱系统中用于在线脱盐的一次性捕集柱Evosep One高效液相色谱系统偶联）从而达到一个自动化进样的目的。
该研究利用5个细胞样本同时用手动进样和自动化进样的方法来评估样品转移方式对肽回收率的影响（图1a），结果发现手动进样的样品每次分析运行产生的蛋白质组的中位数为 582 种，而自动化进样 Evotips 的蛋白质组中位数为每个单细胞 812 种蛋白质；手动进样没有丢失具有特定疏水指数（GRAVY）的肽，但自动化进样的结果中检测到了丰度较低的肽（图1c)；两种样品转移策略之间的独特肽序列重叠率为99%，而自动化进样的样品中只有37个独特的肽。这证明了通过proteoCHIP EVO 96的专用设计直接转移样品的好处。
该研究基于图1b和c中使用的默认胰酶ddaPASEF获取策略进一步优化了timsTOF获取方法，发现将样品直接上样与40SPD Evosep One分离方法相结合，可回收约2倍的蛋白质，并将样品通量提高30%。
此外，该研究评估了使用直接Evosep-与手动nanoElute方法获得的基于proteoCHIP EVO 96的单细胞样品的数据完整性和动态范围的差异性(图1e, f)，发现与手工nanoElute方法相比，使用直接转移的Evosep样品的数据完整性提高了12%(图1e)。除了增加肽回收率和减少缺失外，直接转移的Evosep样品与手动nanoElute样品相比显示出相似的动态范围(图1f)。使用手动nanoElute或直接Evosep方法，proteoCHIP EVO 96制备的SCP样品具有接近5个数量级的相似肽段(图1f)。与获取ddaPASEF相比，diaPASEF在直接Evosep SCP样品中获得的前体丰度高于手动nanoElute(图1c vs. f)。基于此，研究团队假设专用diaPASEF采集策略的速度提高与40SPD的峰值容量相结合，使研究团队能够在整个动态范围内更有效地采样前体(图1f)。
图1. 直接进样 VS 手动进样
2、高通量检测的条件仍可鉴定到3500种蛋白质
大多数标准的SCP项目需要获得数百到数千个单细胞来解决组织或群体的异质性，并了解潜在的生物学特性。然而，较短的色谱分离时间对timsTOF SCP的采集速度和有效离子利用率提出了挑战。该研究选用40SPD和80SPD都以100 nL/min的速度分离肽，使用5 cm Aurora Rapid柱，80SPD的通量增加了2倍，结果发现几乎所有用80SPD鉴定的蛋白都可以用40SPD方法鉴定，这证明了该研究团队的SCP工作流程和获取策略的可重复性(图2b)。
接下来用40SPD和80SPD方法研究了定量蛋白的总体丰度。该研究使用80SPD分离方法增加的通量使单细胞分析的动态范围减小了一个数量级(图2c)，选用了E3泛素连接酶作为关注蛋白来研究这种减少对蛋白质鉴定和定量的影响。具体来说，使用40SPD方法，该研究团队在单个细胞中鉴定了50多个E3泛素蛋白连接酶，而使用80SPD方法回收了13个(图2c)。虽然使用80SPD方法检测到的连接酶的强度降低了近一个数量级，但两种方法之间的丰度等级顺序保持不变(图2c)。基于80SPD方法鉴定的数量和动态范围减少，但鉴定的蛋白几乎完全重叠，该研究团队推测未观察到的蛋白丰度较低。实际上，在40SPD中MS1丰度小于1e3的蛋白在80SPD中普遍低于检测限(图2d)。此外，在较短的梯度中更频繁的前体共分离增加了MS/MS扫描的复杂性，并可能导致低丰度前体的信号抑制(图2e)。这表明在降低分析深度的情况下，2倍高的单细胞分析通量是可行的。
图2. 提高通量的蛋白鉴定结果的影响
3、验证LPS诱导的蛋白质组变化在单细胞中的变化
已知脂多糖(LPS)在多种细胞中刺激炎症、产生细胞因子和激活代谢反应。该研究团队研究了基于proteoCHIP EVO 96的SCP工作流程是否可以用于在单细胞水平上分析LPS刺激的影响。为此，选用200 ng/mL LPS (n = 77)和DMSO对照(n = 84)处理常用的人白血病单核细胞系(THP-1 13.7µm) 12小时。处理后的细胞用该研究团队的proteoCHIP EVO 96工作流程处理，转移到Evotips上，并在timsTOF Ultra上用40SPD方法采集数据(图3a)。鉴定了多达1537个蛋白质组，每个细胞中位数为1149个蛋白质组(图3b)，鉴定的蛋白质数量结果与图2a中所示的HEK-293T（26.7µm）细胞相比，由于细胞体积发生变化，单个细胞的蛋白质鉴定种类相对减少(图2a，图3b)；对两组样本鉴定到的蛋白进行差异分析，结果发现，与DMSO对照相比，LPS处理的细胞中有214个蛋白显著上调，而15个蛋白显著下调(图3d；基因集富集分析(GSEA)结果显示LPS处理后的基因集富集通路调节了与干扰素信号通路以及白细胞介素信号等炎症通路有关的蛋白质，特别是白细胞介素-12家族，这与LPS的已知作用一致(图3e)。
图3. 40SPD体系应用于单细胞蛋白组学结果分析
该研究利用专门设计的芯片（cellenONE和proteoCHIP EVO 96）进行样品处理。通过与Evosep One色谱系统的直接接口，实现了在线脱盐和高度可重复的分离，这与Bruker timsTOF相结合，证明了没有人工样品处理的双重识别，最新一代的timsTOF Ultra识别多达4000个，平均每个HEK-293T能鉴定到3500个蛋白质组；同时，该研究还通过高度可重复的单细胞蛋白质组学工作流程，对数百个脂多糖（LPS）扰动的THP-1细胞进行了分析，并鉴定了涉及白细胞介素和干扰素信号传导的关键调节蛋白质。证明了使用timsTOF Ultra进行的基于proteoCHIPevo96的样品制备提供了足够的蛋白质组深度，以研究细胞类型分类之外的复杂生物学。
proteoCHIP EVO 96技术通过其创新设计和与Evosep One的完美结合，在提升样品制备效率、检测深度和通量的同时，显著减少了手动操作带来的误差，为单细胞蛋白质组学研究开辟了新路径。无论是在基础研究中探讨细胞功能的异质性、炎症反应解析以及药物靶标发现等领域，还是在临床研究中开发个性化诊疗方案，该技术都展示出了广阔的应用前景，为探索生命奥秘和攻克疑难疾病提供了强有力的支持，推动了单细胞蛋白质组学高效发展。
基于Thermo Orbitrap Astral高分辨质谱仪和Bruker timsTOF HT设备，结合全流程集成自动化的单细胞分选平台CellenONE，百泰派克生物科技提供精准且高效的单细胞蛋白质组学分析服务。不论是高通量细胞分析还是复杂样品的深度研究，百泰派克生物科技都能为您提供精确可靠的数据支持，定制化的解决方案，为您的科研保驾护航。
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